清洗二代测序数据

Posted at — Jul 28, 2014

1. FastQC

简介：FastQC是用于对二代测序数据质量快速检验的工具，可以输入fastq（fastq.gz）、sam或者bam文件。查看输出结果解释。

平台：所有平台。

安装：依赖Java，下载后直接安装使用。

快速运行：

# 输出分析结果至特定文档
$ fastqc seqFile1 --outdir setFolder1

# 支持批量处理测序数据
$ fastqc seqFile1 seqFile2 seqFileN

# 查看帮助信息
$ fastqc --help

# 查看一共分析了多少个reads，比如fastqc文件为“accepted_filtered_fastqc.zip”
$ unzip -p accepted_filtered_fastqc.zip accepted_filtered_fastqc/fastqc_data.txt | \
      sed -n '7 p' | \
      awk '{print $3}'

2. Trim Galore!

简介：Trim Galore!是对FastQC和Cutadapt的包装。可以处理Illumina、Nextera 3和smallRNA测序平台的双端和单端数据，包括去除adapter和低质量reads。

平台：Linux

安装:

需要先分别安装FastQC和Cutadapt，其中Cutadapt安装使用

# pip install cutadapt

快速运行：

# 处理双端测序结果
$ trim_galore --quality 20 --phred33 --stringency 3 --length 20 --paired \
              --gzip --output_dir human_trimgalore \
              mySeq_1_1.fastq.gz mySeq_1_2.fastq.gz

重要参数解释：

--quality：设定Phred quality score阈值，默认为20。
--phred33：：选择-phred33或者-phred64，表示测序平台使用的Phred quality score。
--adapter：输入adapter序列。也可以不输入，Trim Galore!会自动寻找可能性最高的平台对应的adapter。自动搜选的平台三个，也直接显式输入这三种平台，即--illumina、--nextera和--small_rna。
--stringency：设定可以忍受的前后adapter重叠的碱基数，默认为1（非常苛刻）。可以适度放宽，因为后一个adapter几乎不可能被测序仪读到。
--length：设定输出reads长度阈值，小于设定值会被抛弃。
--paired：对于双端测序结果，一对reads中，如果有一个被剔除，那么另一个会被同样抛弃，而不管是否达到标准。
--retain_unpaired：对于双端测序结果，一对reads中，如果一个read达到标准，但是对应的另一个要被抛弃，达到标准的read会被单独保存为一个文件。
--gzip和--dont_gzip：清洗后的数据zip打包或者不打包。
--output_dir：输入目录。需要提前建立目录，否则运行会报错。

3. Trimmomatic

简介：Trimmomatic是针对Illumina高通量测序平台设计的接头去除和低质量reads清洗软件。软件中包括有Illumina平台常见接头序列，可以很方便处理单端和双端RNA-seq数据。Trimmomatic也支持自己设计要去除的接头序列文件。

平台：Java跨平台使用

快速运行：

# 处理双端测序结果
$ java -jar /path/trimmomatic-0.33.jar PE\
       -threads 12 -phred33 -trimlog mySeq_1-trim.log \
       mySeq_1_1.fastq.gz mySeq_1_2.fastq.gz \
       mySeq_1_1-trim.fastq.gz mySeq_1_1-unpair.fastq.gz \
       mySeq_1_2-trim.fastq.gz mySeq_1_2-unpair.fastq.gz \
       ILLUMINACLIP:/path/TruSeq3-PE.fa:2:30:10 \
       LEADING:3 \
       TRAILING:3 \
       SLIDINGWINDOW:4:15 \
       MINLEN:51

重要参数解释：

-threads：设置线程数目。
-phred33：选择-phred33或者-phred64，表示测序平台使用的Phred quality score。查询方法：首先，运行FastQC，在结果报告第一项会“猜出”测序平台。之后，查询平台对应Phred列表。
-trimlog：输出运行日志。日志中包括对每一个read具体选择数据，所以文件会比较大。
ILLUMINACLIP：跟随四个参数，分别是:<fastaWithAdaptersEtc>为adaptesr文件完整路径（在Trimmomatic的默认安装目录下的 adapter，有整理好的）；<fastaWithAdaptersEtc>为seed matches（16bases）在匹配时的最大错配数目；<palindrome clip threshold>对于一对reads当得分超过30（约50 bases），seeds会被延伸和固定；<simple clip threshold>，对于单端reads当得分超过10（约17 bases），seeds会被延伸和固定。
LEADING和TRAILING：分别为去除read头部和尾部的低质量（低于quality3）碱基数目。
SLIDINGWINDOW：跟随两个参数，分别是 <windowSize>为扫描“窗口”长度；<requiredQuality>为窗口碱基质量的平均阈值，低于此会被删除。
MINLEN：设置最短reads数目。需要根据下游alignment软件设定，比如Bowtie适用于短序列，比如50bp以下；而Bowtie2适用于50bp以上。TopHat 则根据实际使用Bowtie或者Bowtie2选择。

更新记录

2016年9月10日

Yulong Niu

个人博客

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1. FastQC

2. Trim Galore!

3. Trimmomatic

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