RNA-Seq相比较基因芯片，价格虽然昂贵一些，精度和灵敏度更高。同时，在测序深度足够时，也可以检测mRNA选择性剪切类型。

1. 样品制备

2. 测序

Illumina双端测序动画和图示。

3. 分析流程

RNA-Seq主要分析流程：

原始数据质量评估 -->
数据清洗（去除接头和低质量read） -->
清洗数据质量评估 -->
map测序结果至基因组（转录组） -->
map数据质量评估 -->
差异表达基因/选择性剪切/新基因/融合基因选择 -->
GO和pathway分析 -->
共表达网络分析

3.1 序列清洗

序列清洗主要是去除测序结果中的adapter或通用引物等。

以下使用Illumina HiSeq2000平台，对一个人类样本的RNA测序。统计各种序列清洗方法和选择后的reads数目。原始数据两端测序reads分别为54,492,228和54,492,228。

*：使用TopHat2把序列mapped到hs19基因组。TopHat2默认设置为，如果一个reads能mapped到多个位点，则都会报道。因此数目可能比原始数据多。

4. 分析过程注意事项

1. 参考转录组注释文件（GFF/GTF）的染色体编号，与基因组信息一致。比如都用chr1，或者都用1标识1号染色体。可能出现问题地方：

• TopHat的-G/--GTF参数。

• MISO程序pe_utils的传入转录组注释文件。

5. 基本概念

• Read：是组成测序的结果的基本单位。

• Count：在某次测序中，对于某个指标（比如某个基因），得到的reads数的总和。

• RPKM（Reads Per Kilobase per Million）和FPKM（Fragments Per Kilobase per Million）：

  • 首先需要解释FPKM和RPKM的原理是相似的，区别在于FPKM对应的是DNA片段，比如在一个Illumina的pair-end（双尾）RNA-Seq中，一对（两个）reads对应是一个DNA片段。有了FPKM（RPKM）概念，我们就能比较：同一个样本中基因A和基因B的相对表达量；或者不同样本中，同一个基因的相对表达量。

  • 具体的原因是：引入“每一千碱基（per kilobase）”的原因在于，不同的RNA可能有不同长度，长度越长，对应的reads就越多。当每个RNA都除以自身长度（以1000碱基为单位）时，就可以比较同一个样本中不同基因的相对表达量了。相似地，引入“每一百万reads”的原因是，不同的样本可能测序的深度不一样，深度越深，当然对应的reads就越多了。如果结果除以各自库的数量（以一百万reads为单位），那么我们就能很好地衡量两个不同样本中同一个基因的相对表达量。

• Alignment：确定测得的reads在基因组上的位置的过程。

• Mapping：确定aligned reads对应的转录本。

• Pair end (PE)和Mate-Pair (MP)：

  • 两种双端测序的方法，主要区别在样品库制备和测序上。比如PE制备的库是adapter在目标序列两端，而MP库中adapter在目标序列中间。因此，在数据分析时，MP类型测序必须注意剔除adapter。具体参考论坛讨论和Difference Between Paired-End and Mate-Pair Reads。

  • 在序列软件软件中，有时也称呼一对测序reads（对同一个目标片段分别测得的正义链和反义链），它们互为mate，分别存在两个对应的测序结果文件中。

• Adapter（接头）、Barcode（标签）和Insert（插入片段）：

  • adapter是一段短的序列已知的核酸链，用于链接序列未知的目标测序片段。

  • barcode，也称为index，是一段很短的寡居核酸链，用于在多个样品混合测序时，标记不同的样品。

  • insert是用于测序的目标片段，因为是包括在两个adapter之间，所以被称为“插入”片段。

  • 一个常见测序片段类似与adapter--barcode--insert--adapter。测序开始时前几个碱基无法测得，第一个adapter在数据输出时被去除；由于测序仪读长限制，第二个adapter通常无法测得。所以，经常得到类似 barcode--部分insert的read。最后，把barcode去除，只保留测度insert的片段，这个操作的术语是demultiplexing。

  • 需要注意的是，Illumina TruSeq样品库制备方法中，barcode是在adapter中部，而且是与insert分开测序。而Illumina Nextera Mate Pair样品库制备中，adapter在目标序列中部。

• Concordant Pairs和Discordant Pairs：根据Bowtie2的解释，concordant pairs表示一对reads在alignment时，既方向匹配又有合适距离（Bowtie2中是200bp～500bp）。如果上述方向和距离，任意一个条件不满足，则称为discordant pairs。

• chrN_random和chrUn：基因组文件中通常含有类似chr9_gl000198_random和chrUn_gl000211的基因组。根据UCSC解释，chrN_random包括基因组已知但具体位置未知序列，或者位置已知但具体内容未完成序列。ChrUn中包括一些具体位置未知的序列。

• chrN_xxx_hap1：转录组注释文件中会出现类似chr6_apd_hap1和chr6_dbb_hap3的基因组注释。根据UCSC解释这些基因组是单倍型(haplotype)基因组。

参考网址

• 推荐幻灯片RNA-Seq quality control and pre-processing

• Bioconductor详细流程

• RPKM和FPKM：1、 2和3一个计算RPKM的例子

• ENCODE推荐的RNA-Seq数据分析指导 The ENCODE Consortium: Standards, Guidelines and Best Practices for RNA-Seq

• RNA-Seq差异表达分析工作流程：中文，英文

• 多少个read才够

• Bowtie2对一些常用名词解释

• 二代测序中barcodes index的介绍

• Illumina样品制备参考：Illumina TruSeq DNA Adapters De-Mystified和Illumina adapter and primer sequences

• Best Practices and Suggestions for Read Alignment

• Using RNA-Seq to quantify gene levels and assay for differential expression

更新记录

2017年9月16日